Analiza dakryolitu od pacjentów z leczeniem miejscowym

Dakryolity łez są często diagnozowane podczas dakriocystorhinostomii (DCR), chociaż ich przyczyna jest niejasna. Niektórzy autorzy opisali składniki dakrytolitu, aby ujawnić mechanizm ich powstawania. W kilku badaniach opisano etiologię oraz związek płci i wieku związany z niedrożnością przewodu nosowo-łzowego (NLDO) i paleniem; jednak wyniki każdego badania różniły się zgodnie z ograniczoną frekwencją.

Raporty opisują składniki dakryolitu. Paulsen i in. [3] podali, że peptyd czynnika (TFF) i mucyny są głównymi składnikami dakryolitu. Iliadelis i in. [4] przeprowadzili analizę histochemiczną dakryolitu w serii procedur DCR. Badanie histologiczne ujawniło bezkomórkowy materiał organiczny i ograniczone osadzanie soli wapnia, podczas gdy analiza chemiczna wykazała głównie organiczne (ponad 90%) i minimalny materiał nieorganiczny jako składniki dakrytolitu. Orhan i in. [5] podobnie opisali, że dakryolity składają się z materiałów amorficznych i materiałów organicznych. Jednak w poprzednich badaniach nie udało się zidentyfikować rodzaju materiału organicznego. Lew i in. [6] podali zmiany w stężeniu elektrolitów i białek w próbkach łez u pacjentów z NLDO i wykryli niskie poziomy lizozymów. Jednakże w ich badaniu nie wykryto immunologicznie żadnego specyficznego białka wywołującego.

Dakryolity zazwyczaj charakteryzują się żółtawymi twardymi kamieniami, którym towarzyszy wydzielina z nosa i łzów (ryc. 1). Zauważyliśmy unikalne tworzenie dakryolitu, które było raczej białe i kruche u pacjentów z długotrwałym stosowaniem (ponad 6 miesięcy) kropli do oczu rebamipidu (ryc. 2). Postawiliśmy hipotezę, że istnieją różne kompozycje białek między dakryolitami od pacjentów, którzy nie stosowali kropli do oczu rebamipidu i dakryolitu od pacjentów, którzy stosowali krople do oczu rebamipidu przez długi czas i próbowaliśmy zidentyfikować główny skład białek, stosując nową analizę proteomiczną. Sekwencje peptydów zidentyfikowanych białek analizowano za pomocą Unipept, niedawno opracowanej aplikacji internetowej o otwartym źródle, zaprojektowanej do badania różnorodności biologicznej złożonych próbek metaproteomów.

Pacjent i tkanki
Retrospektywną ocenę dakryolitu z zastosowaniem analizy proteomicznej przeprowadzono w jednym ośrodku.

Próbki tkanek (dakryolity w worku łzowym) uzyskano od 7 pacjentów (Tabela 1), u których wykonano endo-DCR lub łzową endoskopową operację NLDO (1 mężczyzna, 6 kobiet, w wieku 69-82 lat, średni wiek 75,6 roku) w Tane Memorial Eye Hospital od kwietnia 2015 do grudnia 2016. Materiał z zabiegów chirurgicznych uzyskano za zgodą komisji ds. Etyki lekarskiej i stosowano zgodnie z Deklaracją Helsińską. Pacjentów poddano dokładnemu przeglądowi na czas epiforii, historię ostrego zapalenia drożdżakowego, ogólne warunki (występowanie raka lub zespół Sjogrena, który może powodować ciężkie suche oko), stosowanie kropli do oczu rebamipidu i czas stosowania kropli do oczu.

Próbki dakryolitu analizowano w Departamencie Patologii Strukturalnej, Centrum Badań Nerek, Uniwersytecie Graduate Medical Medical and Dental Sciences w Niigata, i stosowano do przeprowadzania identyfikacji białka i analizy metaproteomicznej.

Każdemu pacjentowi zdiagnozowano NLDO (przypadek 2 miał również zapalenie kanału nerkowego, dodatkowo), któremu towarzyszyło wyładowanie oporne na leczenie, z ostrym zapaleniem mięśnia sercowego w wywiadzie i poddano DCR lub chirurgii endoskopowej. Pierwszych czterech pacjentów nigdy nie podawano z miejscowym leczeniem rebamipidem w ich historii medycznej. Pacjenci 5-7 pacjentów mieli w przeszłości miejscowe leczenie rebamipidem.

W tych trzech przypadkach krople do oczu rebamipidu podawano przez 6 miesięcy w przypadku ciężkich, suchych oczu, a dakryolity z zastosowaniem kropli do oczu rebamipidu były większe i bielsze niż te bez użycia kropli do oczu rebamipidu. Pacjenci nie mieli objawów ogólnoustrojowych, w tym zespołu Sjogrena i raka.

Ekstrakcja białek z dakryolitu
Każdą próbkę dakryolitu podzielono na małe kawałki za pomocą pincety. Dakryolity od pacjentów leczonych kroplami rebamipidu były łatwiejsze do przecięcia niż u pacjentów, którzy nigdy nie otrzymali rebamipidu. Kawałki dakryolitu zawieszono w buforze do próbek dodecylosiarczanu sodu (SDS) (2% SDS, 10% glicerolu, 62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8 i 2% 2-merkaptoetanolu) i homogenizowano, stosując homogenizator Polytron (Kinematica, Littau, Szwajcaria). ) i dezintegratora ultradźwiękowego (Hielscher, Teltow, Niemcy). Homogenat ogrzewano w 95 ° C przez 10 min i odwirowano przy 20 000 g przez 20 min, aby uzyskać supernatant jako ekstrakt białkowy.

Trawienie trypsyną do spektrometrii masowej
Ekstrakt białkowy (30 μL zawierający 10 μg białka) został przeniesiony do nowej probówki mikrowirówkowej do trawienia w żelu – zmodyfikowanej procedury trawienia trypsyną w żelu [7] w celu wytworzenia peptydów trypsynowych z redukcją ditiotreitolu, jodoacetamidem nano-przepływowa chromatografia cieczowa sprzężona z tandemowym spektrometrem mas (LC-MS / MS). Krótko mówiąc, ekstrakt białkowy był
[hasła pokrewne: hydrokortyzon maść, citotrop, stomatolog pruszków ]